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[求教]多片段克隆
[版面:生物学][首篇作者:CHUNan] , 2017年09月12日12:08:24
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CHUNan
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发信人: CHUNan (CHUNan), 信区: Biology
标  题: [求教]多片段克隆
关键字: Multiple-fragment cloning
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 12:08:24 2017, 美东)
最近要将一个 3k+1k+2k的片段分别克隆到一个3k和8k 的载体上。试了两周Infusion
clone (Clontech, TAKARA)没弄出来。 Trouble-shooting过, 也用过overlap PCR
先assemble两个片段。但是仍然得到的是阴性结果(基于Colony-PCR和Restriction
enzyme digestion)。
之前一直用Infusion clone,虽然效率有高有低,但是这次彻底挂了。

理论上说Infusion比Gibson要效率高。当然其他方法如Golden Gate cloning, 还有
yeast recombination也许能行。不过似乎都有点麻烦。

请问各位大虾,对于我的这种情况,有没有其他类似高效快速的方法,或者克隆效率低
的可能性是什么呢?

不甚感谢。


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※ 修改:·CHUNan 於 Sep 12 21:42:42 2017 修改本文·[FROM: 2620:0:691:b358:]
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iloveYolanda
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发信人: iloveYolanda (Josh), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 15:53:45 2017, 美东)

你这种片段应该gibson assembly很容易的,GA的话摩尔比很重要,我记得4个片段可以
能要vector:insert 1:3吧,而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗?可以
用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。
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CHUNan
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发信人: CHUNan (CHUNan), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 16:15:17 2017, 美东)

谢谢回复。
没用过GA,感觉其实原理都类似。用Clontech 的Infusion,因为实验室刚好有这个kit
,然后Infusion的宣传页刚好有一个section,比较和GA的效率高低。那个brochure上
的数据显示Infusion比GA阳性率高得多...

引物设计是用Infusion的web-tool的。每条片段有20bp的overlap。PCR setup中的
Insert和plasmid ratio 也是根据web-tool建议的(2:1)。web-tool最后也给一个载
体图(.gb格式,和snap gene类似吧)。理论上说是不会设计错误的。


【 在 iloveYolanda (Josh) 的大作中提到: 】
: 你这种片段应该gibson assembly很容易的,GA的话摩尔比很重要,我记得4个片段可以
: 能要vector:insert 1:3吧,而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗?可以
: 用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。




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※ 修改:·CHUNan 於 Sep 12 16:16:02 2017 修改本文·[FROM: 2620:0:691:b358:]
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dimorphism
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发信人: dimorphism (雷小阿伦), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 18:13:51 2017, 美东)

几年没做过克隆了,技术贴帮顶。
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dahuzi
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发信人: dahuzi (huhuhu), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 22:59:02 2017, 美东)

我很多年以前国内时候做过类似的,那时候没见过高级的做法,就是把每个片段和载体
的末端设计好,然后每个片段和载体分别纯化好(载体切开后跑电泳时间长些确保切开
和分开了),做常规连接,多做好几管反应,分别转化涂板子。一般来说长出来的克隆
会很少,甚至非常少,少到一两个,但是由于片段之间的末端位点都不一样,一旦长出
来99%几率是阳性的。
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NGale
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发信人: NGale (马氏若姆), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Sep 12 23:18:58 2017, 美东)

我一直用Clontech In-fusion,曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体,一次
成功。In-fusion效率几乎100%,以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来,
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。

用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp,另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中,其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1:1:1:0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了,网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
,那么3kb是150ng,1kb是50ng,2kb是100ng。建议所有片段PCR,然后跑胶纯化,
nanodrop测浓度。如果浓度不高,那么可以整体scale down,但是ratio一定要是1:1
:1:0.5。

等有了8kb这个克隆,你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb,然后在用infusion到3kb载体
中。

载体的PCR尽量用极少的template,以防质粒污染PCR纯化结果。或者PCR完成后直接用
DpnI处理半小时。

如果你始终无法克隆,那说明目标质粒在Ecoli中不稳定,这种情况我见过,你就另想
办法了。

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shylook
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发信人: shylook (shylook), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Sep 13 09:30:09 2017, 美东)

我也用in-fusion好多年了 载体切彻底了 确实基本只需要挑一个克隆测序
连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
【 在 NGale (马氏若姆) 的大作中提到: 】
: 我一直用Clontech In-fusion,曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体,一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%,以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来,
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp,另外就是
insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中,其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1:1:1:0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了,网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ,那么3kb是150ng,1kb是50ng,2kb是100ng。建议所有片段PCR,然后跑胶纯化,
: nanodrop测浓度。如果浓度不高,那么可以整体scale down,但是ratio一定要是1:
1
: :1:0.5。
: ...................



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CHUNan
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发信人: CHUNan (CHUNan), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Sep 13 10:50:10 2017, 美东)

谢谢分享您的经验。

我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页,用起来也很方便。
overlap区域的话是20bp,也是自动设计的。理论上说长一些的话,效率会更高一些。

这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
Qiagen的,后来嫌yield太低,换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样,但是应该不
会问题太大。

打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下,然后也order了一个 NEB
的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话,只能换其他方法了。


【 在 NGale (马氏若姆) 的大作中提到: 】
: 我一直用Clontech In-fusion,曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体,一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%,以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来,
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp,另外就是
insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中,其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1:1:1:0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了,网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ,那么3kb是150ng,1kb是50ng,2kb是100ng。建议所有片段PCR,然后跑胶纯化,
: nanodrop测浓度。如果浓度不高,那么可以整体scale down,但是ratio一定要是1:
1
: :1:0.5。
: ...................



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CHUNan
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发信人: CHUNan (CHUNan), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Sep 13 10:51:42 2017, 美东)

您是两个片段连接?(1 insert + linearized plasmid)。多片段的话,效率应当不
会这么高。

【 在 shylook (shylook) 的大作中提到: 】
: 我也用in-fusion好多年了 载体切彻底了 确实基本只需要挑一个克隆测序
: 连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
: insertion
: 1



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iloveYolanda
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发信人: iloveYolanda (Josh), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Sep 13 13:30:57 2017, 美东)

祝好运吧!
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发信人: NGale (马氏若姆), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Sep 13 19:36:37 2017, 美东)

那个网页做得很差,你还不如自己手动检查一下你的linker region是否正确。三个
linker region必须不同,否则会全部自连。

我记得In-fusion说明书上说过15bp时效率最高。你说的越长越好应该是指Gibson
cloning。

【 在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到: 】
: 谢谢分享您的经验。
: 我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页,用起来也很方便。
: overlap区域的话是20bp,也是自动设计的。理论上说长一些的话,效率会更高一些。
: 这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
: Qiagen的,后来嫌yield太低,换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样,但是应该不
: 会问题太大。
: 打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下,然后也order了一个
NEB
: 的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话,只能换其他方法了。
: insertion
: 1



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zyh
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发信人: zyh (CH2O), 信区: Biology
标  题: Re: [求教]多片段克隆
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Sep 14 08:23:27 2017, 美东)

Try Simple Cloning.
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